1482年達•芬奇來到米蘭，應聖弗朗切斯教堂的邀請繪制山水畫祭壇畫《岩間聖母》。這幅畫現藏於盧浮宮。《最後的晚餐》是他在這一時期的創作中最負盛名之作。這幅表現基督被捕前和門徒最後會餐訣別場面的濕壁畫，繪制在米蘭格雷契修道院飯廳的牆壁上。它巧妙的構圖和獨具匠心的布局，使畫面上的廳堂與生活中的飯廳建築結構緊密聯結在一起，使觀者感覺畫中的情景似乎就發生在眼前。在人物布局上，一反平列於飯桌的形式，將基督獨立於畫面中央，其他門徒通過各自不同的表情和手勢，分別表現出驚恐、憤怒、懷疑、剖白和慌張的情緒。這種典型性格的描繪，突出了繪畫的主題，它與構圖的統一效果互為補充，堪稱美術史上最完美的典範之作。1500年達•芬奇回到佛羅倫薩，隨著共和國制度的恢復，文化氣氛一度活躍，畫壇上也先後出現了米開朗基羅、拉斐爾等傑出人物。達•芬奇開始為蘭則塔大教堂的主祭壇創作《聖母子與聖安娜、聖約翰》，他向市民展出的一幅經過精心構思的《聖母子與聖安娜、聖約翰》素描草圖，立即引起轟動，其構圖原理和畫法對藝術界有極大影響，米畫開朗基羅和拉斐爾等人也從中得到啟發。1503年他一面著手為市政廳繪制壁畫《安吉裡之戰》，一面創作《蒙娜麗莎》和《聖母子與聖安娜、聖約翰》（後成為《聖母子與聖安娜》），這兩幅畫和《施洗者聖約翰》一起成為他極為珍愛的作品，始終帶在身邊，晚年移居法國也不離左右，最後遺存巴黎。1499年為躲避戰亂，達•芬奇在曼圖亞和威尼斯等地旅游並進行一些科學研究。

1500年達•芬奇回到佛羅倫薩並開始創作《蒙娜麗莎》。這之後達•芬奇再去米蘭，並繼續服務於米蘭宮廷。

1513 年移居羅馬，羅馬對於列昂納多來說並不是很討人喜歡的地方。他在那裡做了短暫的停留，見到了米開朗基羅和其他當時在羅馬的藝術家，但並沒有顯露他任何的藝術天才。他在那裡基本上是研究一些類似於魔法的小把戲，以至於羅馬人當他是巫師一類的人物。

1515年達•芬油畫奇移居法國，最後定居昂布瓦斯。

晚年極少作畫，潛心科學研究，去世時留下大量筆記手稿，內容從物理、數學到生物解剖，幾乎無所不包。他一生完成的繪畫作品並不多，但件件都是不朽之作。其作品具有明顯的個人風格，並善於將藝術創作和科學探討結合起來，這在世界美術史上是獨一無二的。學術界一般將其創作活動分為早期和盛期兩個階段。

巨人長眠

達•芬奇晚年被法蘭西國王弗朗索瓦一世邀入法國，弗朗索瓦一世給予了他至高的接待，將其安置於昂布瓦斯城堡中的克魯克斯莊園，並時不時地去請教。1519年5月2日，年事已高的達•芬奇因病逝世了，據說他是在趕來的弗朗索瓦一世懷中咽下了最後一口氣。他最鐘愛的學生弗朗西斯科•梅爾茲（達•芬奇臨終前將所有繪畫作品和大量手稿都托付給了他）說：“達•芬奇的死，對每一個人都是損失，造物主無力再造出一個像他這樣的天才了。”

達芬奇化作：最後的歸宿克魯克斯莊園

“上天有時將美麗、優雅、才能賦予一人之身，令他之所為無不超群絕倫，顯出他的天才來自上蒼而非人間之力。列昂納多正是如此。他的優雅與優美無與倫比，他的才智之高可使一切難題迎刃而解。”這是文藝復興時期的傳記作家瓦薩裡對達•芬奇的溢美之詞。