數值孔徑（Numerical Aperture，NA）顯微鏡

聚光鏡的數值孔徑該如何調節？

數值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標志。其數值的大小，分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。數值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率（n）和孔徑角（u放大鏡）半數的正弦之乘積。用公式表示如下：

NA=nsinu/2

孔徑角又稱“鏡口角”，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效望遠鏡直徑所形成的角度。孔徑角越大，進入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正天文望遠鏡比，與焦點的距離成反比。顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質的折射率n值。基於這一原理，就產生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質的折射率n值大於1，NA值就能大於1。數值孔徑最大值為1。4，這個數值在理論上和技術上都達到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質，溴萘的折射金相顯微鏡率為1。 66，所以NA值可大於1。4。

　　1、顯微鏡照明光路系統的調整

　　為了使顯微鏡的視野能受到金相顯微鏡均勻而又充分的顯微鏡照明，在顯微鏡初次安裝和調試時，就必須把照明光路系統調整好，這是正確使用顯微鏡，並獲得正確、可靠結果的重要手段和最基本的要求。此外，正確掌握照明光路系統的調整，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡後所必經的步驟，也是在日常使用過程中不時地檢驗顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統的調整主要有以下4項內容：

　　(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調整

　　ヾ 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素燈泡裝入插座中，安裝時避免手指直接接觸燈泡(可用柔軟的布放大鏡或紙隔住)，以免燈泡上留有指紋等髒物，影響燈泡的使用壽命。

　　ゝ 把燈室擺在桌面上，接通電源後，用專用的螺絲刀調節燈的調焦旋鈕孔(標有“←→”)，使燈絲投影在1-2m外的牆上，將燈絲成像調至清晰；然後調節燈的高低位望遠鏡置調節絲孔(標有“──”)使燈絲位置高低適當；再調節燈的左右位置調節螺絲孔(標有“──”)，使燈絲左右位置合適。

　　(2) 光源發光體(燈絲)在顯微鏡內位置的檢驗和校正。目的是為了把發光體的像端端正正地調入物鏡的視天文望遠鏡域範圍內，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調整庫勒照明系統的前提條件。

　　(3) 庫勒照明(Kohler)系統的正確調整。顯微鏡的正確調試，主要工作之一是照明光路系統的調整，而其中的關鍵是庫勒照明系統的調整。對於每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照相的人員來說，應該對庫勒照明系統的原理及其調整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發揮顯微鏡應有的功能，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。

 
　　熒光顯微鏡是熒光顯微檢測的專用工具，它是光學顯微鏡天文望遠鏡的顯微鏡一種，是對某些物質進行定性和定量研究的工具之一。

　　細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射後可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色後，經紫外線照射亦可發熒光。

　　熒光顯微鏡的成像機理是利用波長較短的放大鏡光照射樣品時，會發望遠鏡射出波長較長的光譜，當照射光停止照射時，這種激發的熒光會立即消失。

　　熒光顯微鏡根據照明方式的不同可分為透射式與落射式，但由於透射式對眼睛易造成金相顯微鏡傷害，因而常采用落射式照明。

　　近年來熒光顯微成像技術得到了廣泛的應用與發展，已形成了熒光生物顯微鏡、熒光體視顯微鏡、熒光偏光顯微鏡、熒光壽命成像分析顯微系統等。

 

　　(1)照明系統：包括光源和聚光鏡；

　　(2)望遠鏡光學放大系統：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復雜的透鏡組構成；

　　(3)機械裝置顯微鏡：用於固定放大鏡材料和觀察方便。

　　顯微鏡物像是否清楚不僅決定於放大倍數，還與顯微鏡的分辨率有關，分辨率是指顯微鏡(或人的眼睛距目標250mm處)能分辨物體最小間隔的能力，分辨率的大小決定於光的波長和數值孔徑(鏡天文望遠鏡口率)以及介質的折射金相顯微鏡率，用公式表示為：

　　R=0。61λ /NA NA=nsinα

　　式中：n=介質折射率；α=孔徑角(鏡口角標本對物鏡鏡口的張角)，NA=數值孔徑(鏡口率)。孔徑角總是要小於90°，所以sinα的最大值必然小於1。

 

　　1、明視場

　　傳統的顯微鏡觀察方法，特別是在醫放大鏡療和生物學領域，用於例如組織切片和塗片一類的染顯微鏡色組織試樣。

　　2、暗視場

　　這種對比方法可在一台照明顯微鏡的有限的分辨率，甚至低於這種分辨率的條件下，觀察細小的結構特性。特別適用於使用反射光的金相和晶體檢驗。需要特殊的聚光鏡，某些情況下需要用油望遠鏡鏡觀察。

　　3、相位對比

　　相位對比方法特別適用於觀察極薄的(小於5μm)，無染色的試樣中的組織或單細胞的，極為細小的組織特點，這種試樣使用其他方法只能獲得非常差的對比度。需要特殊的物鏡和專用的聚光鏡。

　　4、VAREL

　　VAREL是一種使用浮凸方法，顯示試樣結構的對比方法。 由於這種方法對偏振光效應(DIC)不敏感，因而特別適用於放置在塑料容器內的試樣。需要特殊的物鏡和專用的聚光鏡。

　　5、DIC

　　這種Nomarski微分干涉對比(DIC)方法以類似於浮雕的方法，顯示試樣的相差。此方法特別適用於厚的無染色試樣(>5μm)。需要在照明和成像光纖路徑內使用專用的、相對較為昂貴的附件(棱鏡、偏光鏡)。

　　6、偏振觀察

　　偏振對比方法用於識別生物試樣的雙折射結構(晶體)。但是，其主要應用於使用反射和投射光的金相和晶體檢驗。需要起偏鏡、檢偏鏡、和補償鏡。

　　7、熒光觀察

　　熒光方法使用熒光色素和特殊的標記技術來觀察微小的組織和細胞結構。這種成像方式(天文望遠鏡自發光物)組合了最高的檢測敏感度和最高的檢測特異性(生物化學標記物)。需要反射光照明裝置(反射鏡)、濾鏡、雙色分光鏡金相顯微鏡、激勵光源。